H1人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備

一.試劑準(zhǔn)備

1)hESC/iPSC培養(yǎng)基配制(500 mL)

1. 在4條件下解凍hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍。

2. 參考表1在生物安全柜中，使用無(wú)菌移液管混勻下列成分配制成hESC/iPSC培養(yǎng)基，之后置于4儲(chǔ)存，封口膜封好后2周內(nèi)使用。

3. 有初培養(yǎng)需擴(kuò)建的需求，建議先配置100 mL,保證2周內(nèi)使用完畢。

2)Matrigel鋪板(以貨號(hào)為354277的Corning Matrigel包被6孔板為例)

A. 分裝 Matrigel

1. 貨號(hào)354277的Matrigel，操作說明中不標(biāo)注蛋白濃度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推薦Dilution Factor為278 μL，則表明278 μL可包被4塊6孔板，分裝數(shù)量=5 mL /0.278=17.98。

2. 準(zhǔn)備18個(gè)無(wú)菌1.5 mL EP管，標(biāo)記Matrigel日期、操作人;1mL無(wú)菌吸頭;EP管架，均置于-20冰箱中預(yù)冷1小時(shí)。

3. 將Matrigel放置4冰箱過夜解凍，當(dāng)Matrigel解凍即可開始分裝。

注：在解凍時(shí)，將Matrigel放置冰箱內(nèi)側(cè)角落，切勿放在靠近冰箱門附近。

4. 準(zhǔn)備一個(gè)裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預(yù)冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。

5. 混勻Matrigel，無(wú)菌分裝于各個(gè)1.5 mL EP管中，并置于冰上。當(dāng)吸頭被堵塞可能導(dǎo)致分裝體積不準(zhǔn)時(shí)需要更換吸頭。

6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20冰箱中保存。

B. 鋪板

1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL離心管中，準(zhǔn)備4個(gè)6孔板，標(biāo)記Matrigel、批號(hào)、日期和操作人。

2. 1 mL無(wú)菌吸頭置于-20冰箱中預(yù)冷1小時(shí)，取出一支冷凍的Matrigel(5mL)置于4冰箱解凍至化凍。

3. 準(zhǔn)備一個(gè)裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預(yù)冷的1mL吸頭放置于生物安全柜上。

4. 用預(yù)冷吸頭向解凍過的Matrigel(5mL)加入1 mL冷的DMEM/F12并反復(fù)吹打解凍混勻。

5. 吸出已解凍混勻的Matrigel加入離心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反復(fù)吹打混勻。

6. 分裝1.5 mL/孔于4個(gè)六孔板中，輕輕搖晃混勻。

7. 培養(yǎng)板置于室溫1小時(shí)后即可使用，或置于4冷藏過夜，兩周內(nèi)使用。

H1人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)H1人胚胎干細(xì)胞復(fù)蘇步驟(以6孔板為例)

1. 將水浴鍋預(yù)熱至37；并將Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時(shí)恢復(fù)至室溫(15~30)。

2. 取4 mL hESC/iPSC培養(yǎng)基，按照1:4000比例加入1 μL的hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫(15~30)。

注意：不要在37水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基。

3. 取出1支冷凍的細(xì)胞置于37水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內(nèi)解凍，肉眼觀察細(xì)胞懸液內(nèi)冰晶即將消失時(shí)取出。

4. 75%酒精無(wú)塵紙擦拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入生物安全柜;將細(xì)胞懸液移到事先準(zhǔn)備好的15 mL 離心管中，隨后緩慢逐滴加入10mL DMEM/F12，過程中輕柔晃動(dòng)混勻細(xì)胞，160g離心5 min。

5. 吸棄上清，加入預(yù)溫的4 mL的hESC/iPSC培養(yǎng)基+hESC/iPSC Supplement C制備細(xì)胞懸液，盡量避免吹打。

注：可留20 μL上清液，輕彈管底，使細(xì)胞懸浮液更均勻，避免成較大細(xì)胞團(tuán)。

6. 吸除6孔板中2孔的Matrigel包被液，將細(xì)胞懸液按照2 mL/孔接種到1個(gè)孔中。

7 水平十字搖勻三次，置于37，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻三次培養(yǎng)。

8. 18-24小時(shí)后換新的hESC/iPSC培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基。

注：在hESC(H1)培養(yǎng)過程中，如果細(xì)胞的匯合度超過50%，建議更換培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)基的體積增加至3-4mL/孔。

培養(yǎng)容器(孔數(shù))底面積DPBS (mL)EDTA傳代工作液hPSC培養(yǎng)基*

2)H1人胚胎干細(xì)胞傳代步驟(以6孔板為例)

1. 傳代條件：① H1人胚胎干細(xì)胞匯合度達(dá)85%左右(如圖1(C-D)所示)，一般情況下每3-4天傳代;

② H1人胚胎干細(xì)胞匯合度較低，生長(zhǎng)密度分布不均勻。

注：即使克隆團(tuán)較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過5天。

2. 傳代比例：可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)需要按1:5~1:12的比例進(jìn)行傳代，如果細(xì)胞正常，克隆團(tuán)匯合度85%，大小均勻(如圖1(C-D)所示)，建議按照1:8進(jìn)行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例;密度偏高，則增加傳代比例。

注：1:8傳代就是1個(gè)孔瓶傳8個(gè)孔(以6孔板為例)。

3. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時(shí)恢復(fù)至室溫(~25)。

4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備2 mL/孔的hESC/iPSC培養(yǎng)基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫(~25)。

5. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時(shí)恢復(fù)至室溫(~25)。

6. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備2 mL/孔的hESC/iPSC培養(yǎng)基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫(~25)。

7. 將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸取，加入2 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂)，輕輕搖晃并吸取。

8. 加入2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液覆蓋孔底。

9. 置于37培養(yǎng)箱中孵育8-9 min。

注：① 消化8-9 min后鏡下觀察細(xì)胞變化，當(dāng)大部分細(xì)胞變亮變圓，且細(xì)胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時(shí)即可終止消化，若大部分細(xì)胞仍未變亮，則需要延長(zhǎng)消化時(shí)間;

② 保持6孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使6孔板受熱均勻，不要疊放。

10. 消化結(jié)束后輕輕地將細(xì)胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細(xì)胞，傾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

11. 及時(shí)加入2 mL/孔預(yù)溫的hESC/iPSC培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字搖晃6孔板使細(xì)胞脫離基質(zhì)。

注：① 加hESC/iPSC培養(yǎng)基 + hESC/iPSC Supplement C時(shí)，可輕柔吹打細(xì)胞1-2次，不能超過2次，避免反復(fù)吹打；有部分細(xì)胞(10%～15%)未脫離基質(zhì)是正?，F(xiàn)象，若有大量細(xì)胞未脫離則需延長(zhǎng)消化時(shí)間(< 10min)。

②hESC(H1)細(xì)胞不能長(zhǎng)時(shí)間處于hESC/iPSC Passage Solution(<15 min)，所以收集接種細(xì)胞時(shí)操作必須快速,以及最好一次操作不要超過4孔(六孔板)。

12. 吸取6孔板中的Matrigel溶液，加入預(yù)溫的hESC/iPSC培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

13. 在6孔板上標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人。將步驟9獲得的細(xì)胞懸液輕輕搖勻，按預(yù)先設(shè)定的傳代比例均勻分配于孔板中。

注：為了鋪板均勻并降低對(duì)細(xì)胞的損傷，可以將步驟9獲得的細(xì)胞懸液收集至2mL離心管，輕柔顛倒混勻細(xì)胞1-2次;再按照傳代比例接種。

14. 接種后，水平十字搖勻6孔板三次，置于37，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中， 再次水平十字搖勻6孔板三次，培養(yǎng)過夜。

15. 18-24小時(shí)后更換新hESC/iPSC培養(yǎng)基，此后每天換液，4-5天后繼續(xù)傳代/凍存。

3)H1人胚胎干細(xì)胞凍存步驟(以6孔板為例)

1. 當(dāng)H1人胚胎干細(xì)胞匯合度達(dá)85%左右(如圖1(C-D)所示)可收獲凍存，一般6孔板每孔可凍存1管。

2. 準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的1.5/2 mL凍存管，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次(P#)、日期、操作人。

3. 取出4冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室溫預(yù)溫，使用前注意搖勻。

4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂)，輕輕搖晃數(shù)次，再吸取。

5. 加入2 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，將細(xì)胞置于37培養(yǎng)箱中，計(jì)時(shí)8-9 min(可參考“六、傳代hESC/iPSC"步驟)。

6. 消化結(jié)束，輕輕取出培養(yǎng)板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。

7. 搖勻預(yù)溫的hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入1 mL凍存液，輕柔吹打，水平十字搖勻3次，隨后吸取細(xì)胞懸液加入1.5/2 mL凍存管中。

8. 將細(xì)胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存。

H1人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)需避免的操作失誤

1.細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)要規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)

通常培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)會(huì)出現(xiàn)污染等問題很大程度原因是由于我們?cè)谂囵B(yǎng)細(xì)胞時(shí)操作方法不夠標(biāo)準(zhǔn)沒有處理好所造成的，因此在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要加強(qiáng)操作規(guī)范。

(1)嚴(yán)格控制無(wú)菌操作。在培養(yǎng)設(shè)備和耗材都準(zhǔn)備好以后就要做好日常的消毒工作嚴(yán)格控制細(xì)菌、真菌、微生物等常見的污染。如果條件有限的情況下可以在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)目股貋?lái)防止污染但是這往往會(huì)影響到細(xì)胞的培養(yǎng)因此要謹(jǐn)慎。

(2)培養(yǎng)環(huán)境需要每日觀察。特別是很多細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)都會(huì)在培養(yǎng)箱中進(jìn)行，其中溫度、適度以及二氧化碳的濃度都會(huì)有嚴(yán)格的要求，如果在培養(yǎng)時(shí)設(shè)備中的環(huán)境出現(xiàn)了偏差那么細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)自然會(huì)出現(xiàn)問題，因此在培養(yǎng)時(shí)應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格檢測(cè)好培養(yǎng)設(shè)備及環(huán)境。

(3)細(xì)胞培養(yǎng)基及相關(guān)試劑的選擇。培養(yǎng)時(shí)會(huì)用到培養(yǎng)基、血清、試劑等物品但是選擇的產(chǎn)品應(yīng)該是優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，劣質(zhì)的產(chǎn)品往往技術(shù)不過關(guān)其中包含很多有害物質(zhì)因此不建議不夠。

H1人胚胎干細(xì)胞注意事項(xiàng)

1. 收到H1人胚胎干細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，干冰運(yùn)輸?shù)募?xì)胞檢查干冰是否揮發(fā)，細(xì)胞是否解凍，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀H1人胚胎干細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 請(qǐng)客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

4. 建議客戶復(fù)蘇細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運(yùn)輸?shù)脑颍?xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。