每天對待細胞比孝敬爹媽還用心，那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丟了。如果手里有一份來自機構(gòu) ATCC 的《細胞培養(yǎng)指南》，養(yǎng)細胞可就得心應手多了。下面是細胞培養(yǎng)指南（精簡版），值得收藏。

綜述

細胞要么在培養(yǎng)瓶表面貼壁生長（錨定依賴性）要么懸浮生長（非錨定依賴性）。細胞的生長和分裂，通常遵循一個由四個階段組成的特征性增長模式：停滯期，對數(shù)期（指數(shù)期），平穩(wěn)期（平臺期）和衰退期。

停滯期——將細胞接種至培養(yǎng)瓶之后，細胞逐步恢復的同時，緩慢生長。
對數(shù)期（指數(shù)期）——細胞進入一個對數(shù)生長的時期，一直持續(xù)到整個生長表面被占滿或細胞密度超過培養(yǎng)基提供營養(yǎng)的能力。
平穩(wěn)期——細胞增殖減慢或停止。
衰退期——如果不更換培養(yǎng)基且細胞數(shù)量不減少，細胞活力會下降，并出現(xiàn)細胞死亡。

為了確保活力，遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定，必須使細胞保持在對數(shù)期。這意味著細胞需要在進入平穩(wěn)增長階段之前，或在單層細胞長成 100% 融合之前，或在懸浮細胞達到推薦的最大細胞密度之前定期進行傳代培養(yǎng)。為每個細胞系繪制生長曲線，對于測定該細胞系的生長特性是必要的。

凍存細胞復蘇

培養(yǎng)一個新的細胞時要特別注意培養(yǎng)基一致性的問題。雖然大多數(shù)細胞系可以在不止一種培養(yǎng)基中生長，但是當培養(yǎng)基改變時，細胞的性質(zhì)也會變化。來自于不同廠家的培養(yǎng)基，即使名字相同或類似，配方也略有差異。仔細閱讀說明書，配方，標簽，確保使用正確的培養(yǎng)基。

細胞復蘇時，應以最快速度融化凍存的細胞溶液，然后迅速與培養(yǎng)基混合，并接種到合適的細胞瓶中。

復蘇程序

1. 準備細胞培養(yǎng)容器（如 T-75 細胞瓶），加入至少 10 ml 適當?shù)呐囵B(yǎng)基，并平衡溫度及 pH。

2. 從液氮罐中取出凍存管，并在 37℃（或適合該細胞的溫度）水浴中緩慢搖動至冰晶融化（約 2 min），注意解凍過程要迅速。

3. 從水浴中取出凍存管，浸泡或者噴撒酒精消毒。后續(xù)的操作，需在無菌操作臺中，并保證嚴格無菌。

4. 擰開凍存管蓋，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有 9 ml 培養(yǎng)基的無菌離心管中。溫和離心 (125 g×10 min)，棄去上清去除凍存保護劑。注意不要擾動細胞層。加入 1-2 ml 培養(yǎng)基重懸細胞，緩慢吹打使細胞團變松散。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至含培養(yǎng)基的容器中充分混合。

5.24 小時后，檢測細胞狀態(tài)。

細胞傳代培養(yǎng)

單層貼壁細胞的傳代培養(yǎng)

為了保證單層貼壁細胞的對數(shù)生長，需要定期傳代。當細胞生長接近指數(shù)生長后期 (匯合率大約 70% 到 90%)，準備傳代。針對傳代過程，ATCC 提供的產(chǎn)品說明中，會推薦細胞傳代分配比例和補充培養(yǎng)基策略。

單層貼壁細胞傳代，需要打斷細胞之間的連接。對于比較松散的連接，猛擊培養(yǎng)瓶側(cè)壁，可以分離細胞。很多情況下，需要胰蛋白酶/EDTA 的蛋白水解酶來消化。對于一些細胞系，需要采用刮等機械方法分離細胞。細胞分離成為單細胞懸液后，稀釋到適當?shù)拿芏炔⑥D(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，在適當?shù)纳L培養(yǎng)基中，細胞將再貼壁生長和分裂。

由于每種細胞都是的，孵化時間和溫度、清洗次數(shù)或溶液配方可能會有所不同。分離過程中，應用顯微鏡密切觀察細胞，以防止細胞損傷。這個過程根據(jù)容器使用合適的培養(yǎng)體積。

懸浮細胞的傳代培養(yǎng)

相對于單層貼壁細胞來說，懸浮細胞的傳代更具有優(yōu)勢，單層貼壁細胞需要蛋白水解酶，會造成細胞損傷。而懸浮細胞可以使用稀釋的方法來傳代，細胞生長沒有延遲，對實驗室空間要求較小，傳代培養(yǎng)是線性放大的。比如細胞可以在發(fā)酵罐中培養(yǎng)。

根據(jù)細胞類型，懸浮培養(yǎng)接種密度從 2×104 至 5× 105 活細胞/ml。收獲時細胞密度 2×106 細胞/ml。如果細胞接種密度過低，他們將經(jīng)歷增長延遲階段，增長非常緩慢甚至死亡。如果細胞密度過高，細胞可能耗盡培養(yǎng)基中營養(yǎng)，而突然si去。

細胞凍存

隨著細胞被冷凍至冰點以下，懸液中冰晶和溶質(zhì)的濃度有所增加。如果冷卻過程中，胞內(nèi)水分可以滲出細胞，則可以減少胞內(nèi)冰晶。通常 1℃/min 的降溫速度可以促進此過程。但是，水分的喪失會導致細胞收縮，當這種收縮達到一定程度，又會導致細胞活性的劇烈下降。冷凍保護劑，如甘油或者二甲基亞砜（DMSO），可以緩解這種效應。細胞凍存的標準程序是在含有冷凍保護劑的培養(yǎng)基中，將細胞緩慢冷凍至–70℃，然后將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮中以保持低于–130℃ 的環(huán)境。

有很多方法可以實現(xiàn) 1℃/min 的降溫速度。電腦控制的可編程電子降溫系統(tǒng)是較好的方式，可以精確保持降溫速度。這也是 ATCC 采用的方法。但這種設備價格較高。比較經(jīng)濟的方式是將凍存管放置于凍存盒中，在低于–70℃ 的冰箱中凍存 24 小時。之后再轉(zhuǎn)移至液氮長期儲存。

以下程序適用于大多數(shù)細胞。凍存培養(yǎng)基的配方請參考細胞說明書。凍存時，細胞應處于指數(shù)生長期。

1. 凍存前先檢測細胞是否受到細菌、真菌、支原體和病毒的污染。如果確定有污染，應將該細胞銷毀。

2. 凍存培養(yǎng)基由培養(yǎng)基和 5%DMSO 組成。由于 DMSO 的溶解會放熱，所以不能向細胞懸液中直接加入未稀釋的 DMSO。

3. 以溫和速度（125 g×10 min）離心收集細胞，并以 1×106-5×106 活細胞/ml 的密度重懸細胞。

4. 在凍存管上標記好細胞名稱，編號和凍存日期等信息。然后每管加入 1-1.8 ml 細胞懸液（視凍存管體積）并密封。

5. 室溫條件下，將細胞在凍存培養(yǎng)基中平衡 15-40 min（勿超）。這段時間中，可以將細胞懸液等分加入凍存管中。

6. 將凍存管置于已預冷至 4℃ 的程序降溫盒，之后置于-70℃（或更冷）的冰箱中至少 24 小時?；蛘呤褂靡杨A冷至 4℃ 的可編程電子降溫系統(tǒng)。

7. 將凍存管迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐或者-130℃ 冰箱。

8. 記錄凍存位置和過程細節(jié)等信息。

9.24 小時后，取出一只凍存管并復蘇，以測定細胞活性和是否污染。